ELISA- Αρχή, τύποι, χρήσεις, πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα

0
ELISA- Αρχή, τύποι, χρήσεις, πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα

Εισαγωγή

  • Ανοσοδοκιμασίες είναι βιοαναλυτικές μέθοδοι, που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση αντιγόνο-αντίσωμα συγκεκριμένες αντιδράσεις και παρέχουν ποιοτική / ποσοτική ανάλυση σε βιολογικά δείγματα.
  • Ανοσοροφητικές δοκιμασίες συνδεδεμένες με ένζυμακοινώς γνωστό ως ELISA ή ΜΠΕ είναι ένας τύπος ανοσοδοκιμασίας και τροποποιημένη έκδοση της κλασικής ραδιοανοσοδοκιμασίας, δηλαδή, αντί για ραδιοϊσότοπα, έχουν αντικατασταθεί ένζυμα (θεωρούνται ασφαλή από το RIA).
  • Για την ELISA, χρησιμοποιείται ένας αριθμός ενζύμων, τα οποία περιλαμβάνουν την αλκαλική φωσφατάση, την υπεροξειδάση χρένου και τη β-γαλακτοσιδάση.
  • ELISA χρησιμοποιείται συνήθως στην κλινική διάγνωση, τον έλεγχο τροφίμων, την ανακάλυψη φαρμάκων και την παρακολούθηση.

Αρχή

  • ELISA βασίζεται σε αντιδράσεις αντιγόνου-αντισώματος, αντιπροσωπεύει τη χημική αλληλεπίδραση αντιγόνου και αντισώματος που παράγονται από κύτταρα του ανοσοποιητικού, π.χ. λευκοκύτταρα
  • ELISA επιτρέπει επιλεκτική ποσοτική/ποιοτική ανάλυση αντιγόνων που περιλαμβάνει επίσης πρωτεΐνες, πεπτίδια, ορμόνες, νουκλεϊκά οξέα, μεταβολίτες.
  • Για την ανίχνευση μορίου, χρησιμοποιείται αντίσωμα ή αντιγόνο σημασμένο με ένζυμο.
  • Το αντιγόνο ακινητοποιείται σε μια πλάκα μικροτιτλοδότησης, που αποτελείται από πολυβινυλοχλωρίδιο, πολυπροπυλένιο και άκαμπτο πολυστυρόλιο.
  • Το πρωτογενές αντίσωμα αντιδρά με ακινητοποιημένο αντιγόνο, το οποίο αργότερα ανιχνεύεται με συζευγμένο με ένζυμο δευτερεύον αντίσωμα. Η παρουσία του αντιγόνου προσδιορίζεται από την ανάπτυξη χρώματος χρησιμοποιώντας χρωμογόνα υποστρώματα (π.χ. αλκαλική φωσφατάση, παραγωγή Π– νιτροφαινόλη (κίτρινο χρώμα) πότε Π– Η φωσφορική νιτροφαινόλη υδρολύεται από ένζυμο, που ανιχνεύεται στα 405 nm).
  • Υποστρώματα χημειοφωταύγειας και φθοριογόνα υποστρώματα μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για πιο ευαίσθητη ανίχνευση.
  • Η αντίδραση ενζύμων-υποστρωμάτων ολοκληρώνεται εντός 30-40 λεπτών, η αντίδραση διακόπτεται με τη χρήση υδροξειδίου του νατρίου, υδροχλωρικού οξέος κ.λπ.
  • Ένας αναγνώστης πλακών μικροτίτλου χρησιμοποιείται για την ανίχνευση, έγχρωμων και φθοριζόντων προϊόντων.

Τύποι ELISA

Κάθε τύπος ELISA μπορεί να χρησιμοποιηθεί ποιοτικά για την ανίχνευση της παρουσίας αντισωμάτων και αντιγόνων. Ακόμη, οι άγνωστες συγκεντρώσεις των δειγμάτων μπορούν να προσδιοριστούν, χρησιμοποιώντας μια τυπική καμπύλη με γνωστές συγκεντρώσεις αντισωμάτων ή αντιγόνων.

  • Απευθείας ELISA αναπτύχθηκε για πρώτη φορά το 1971, έθεσε το βασικό στυλ για άλλους τύπους ELISA με τροποποιήσεις. Σε αυτή την τεχνική, το αντίσωμα ή το αντιγόνο ακινητοποιήθηκε σε μια πλάκα μικροτιτλοδότησης, τα συζευγμένα με ένζυμα αντισώματα αφέθηκαν να αντιδράσουν ακολουθούμενη από ανάπτυξη χρώματος με κατάλληλα υποστρώματα που μετρήθηκαν.
  • Αυτοί είναι κοινοί τύποι ELISA που χρησιμοποιούνται γενικά:
    • Έμμεση ELISA
    • Σάντουιτς ELISA
    • Ανταγωνιστική ELISA

Έμμεση ELISA

Έμμεση elisa

  • Δείγμα που περιέχει πρωτογενές αντίσωμα (Ab1) ή ορός προστίθεται στο φρεάτιο μικροτιτλοδότησης επικαλυμμένο με αντιγόνο και αφήνεται να αντιδράσει με συνδεδεμένο αντιγόνο στο φρεάτιο. [Fig – A & B]
  • Ελεύθερο αντίσωμα (Ab1) πλένεται, το δεσμευμένο αντίσωμα-αντιγόνο ανιχνεύεται προσθέτοντας ένα συζευγμένο με ένζυμο δευτερεύον αντίσωμα, το οποίο δεσμεύει το πρωτογενές αντίσωμα (Ab1). [Fig C]
  • Το ελεύθερο δευτερεύον αντίσωμα, πλένεται και το χρωμογόνο υπόστρωμα προστίθεται για ένα ένζυμο.
  • Μια εξειδικευμένη φασματοφωτομετρική πλάκα χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της ποσότητας των έγχρωμων προϊόντων που σχηματίζονται από την ανάγνωση της απορρόφησης.

Χρήσεις

  • Έμμεση ELISA είναι κατάλληλο για την ανίχνευση της παρουσίας αντισωμάτων ορού (αντισώματα που σχετίζονται με ασθένειες), κατά των ενδοκρινικών νοσημάτων, του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV), του αιτιολογικού παράγοντα του AIDS (Σύνδρομα Επίκτητης Ανοσοανεπάρκειας).
  • Για την ανίχνευση αντιγόνου HIV, στον προσδιορισμό, οι πρωτεΐνες του πυρήνα και ο ανασυνδυασμένος φάκελος του HIV απορροφώνται ως αντιγόνο ακινητοποιημένο σε φρεάτια.
  • Για τα άτομα που έχουν προσβληθεί με HIV, τα αντισώματα ορού θα παράγουν για την ιική πρωτεΐνη και θα αντιδράσουν με τους επιτόπους της.
  • Αυτά τα αντισώματα ορού μπορούν να ανιχνευθούν με Έμμεση ELISA εντός 6 εβδομάδων από τη μόλυνση.

Σάντουιτς ELISA

Σάντουιτς ELISA

  • Σάντουιτς ELISA χρησιμοποιείται για την ανίχνευση ή τη μέτρηση αντιγόνων.
  • Σε αυτή την τεχνική, το πρωτογενές αντίσωμα ακινητοποιείται σε πλάκες φρεατίου μικροτιτλοδότησης [A] όταν προστίθεται δείγμα που περιέχει αντιγόνα, αντιδρά με ακινητοποιημένο αντίσωμα [B].
  • Αφού πλυθεί το φρεάτιο, προστίθεται συζευγμένο με ένζυμο δευτερεύον αντίσωμα ειδικό για διαφορετικούς επιτόπους και επιτρέπει την αντίδραση με δεσμευμένο αντιγόνο. [C]
  • Μετά το πλύσιμο οποιουδήποτε ελεύθερου δευτερογενούς αντισώματος, προστίθεται υπόστρωμα και μετράται το έγχρωμο προϊόν αντίδρασης.

Χρήσεις

  • Χρησιμοποιείται για την ανίχνευση μακρομορίων όπως τοξίνες ή πρωτεΐνες.
  • Για παράδειγμα, Ciguatoxins, αιτιολογικές τοξίνες της δηλητηρίασης από θαλασσινά ciguatera, που παράγονται από θαλάσσιο dinoflagellate Gambierdiscus toxicus , μπορεί να εντοπιστεί από . μονοκλωνικά αντισώματα σε σύστημα ELISA σάντουιτς.
  • Οι θαλάσσιες βιοτοξίνες, π.χ., οι παλιτοξίνες μπορούν επίσης να ανιχνευθούν με ELISA σάντουιτς.

Ανταγωνιστική ELISA

Ανταγωνιστική ELISA

  • Η ποσότητα του αντιγόνου μπορεί να μετρηθεί με ανταγωνιστική ELISA.
  • Σε αυτή την τεχνική, το πρωτογενές αντίσωμα επωάζεται πρώτα σε διάλυμα που περιέχει το αντιγόνο. [A]
  • Μίγμα αντιγόνου-αντισώματος προστίθεται σε αντιγόνο ακινητοποιημένο στο φρεάτιο μικροτιτλοδότησης. [B]
  • Περισσότερα αντιγόνα υπάρχουν στο δείγμα, λιγότερα ελεύθερα αντισώματα θα υπάρχουν για να συνδεθούν στο επικαλυμμένο με αντιγόνο φρεάτιο.
  • Μετράται η προσθήκη συζευγμένου με ένζυμο δευτερογενούς αντισώματος ειδικού για τον ισότυπο του πρωτογενούς αντισώματος που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της ποσότητας του πρωτογενούς αντισώματος που είναι δεσμευμένο στο επικαλυμμένο με αντιγόνο φρεάτιο και τα έγχρωμα προϊόντα αντίδρασης. [C & D]
  • Σε ένα ανταγωνιστική δοκιμασίαη απορρόφηση είναι χαμηλότερη όταν η συγκέντρωση του αντιγόνου στο αρχικό δείγμα είναι υψηλότερη.

Χρήσεις

  • Τόσο τα μακρομόρια όσο και το χαμηλού μοριακού βάρους απτένιο μπορούν να ανιχνευθούν με ανταγωνιστική ELISA.

Πλεονέκτημα της ELISA

  • Απλή Διαδικασία
  • Υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία – Λόγω της αντιδραστικότητας αντισώματος-αντιγόνου
  • Υψηλή απόδοση- Δεν απαιτείται περίπλοκη προεπεξεργασία και μπορεί να πραγματοποιηθεί ταυτόχρονα ανάλυση.
  • Θεωρείται ασφαλές και φιλικό προς το περιβάλλον
  • Οικονομικά Αποτελεσματικές Αναλύσεις

Μειονέκτημα της ELISA

  • Οι παρασκευές αντισωμάτων είναι μια δαπανηρή και επίπονη διαδικασία
  • Υψηλές πιθανότητες ψευδώς θετικών και αρνητικών.
  • Αστάθεια αντισωμάτων
  • Απαιτείται μεταφορά και αποθήκευση στο ψυγείο για τα αντισώματα.

Αναφορές και Πηγές

  • https://www.biologydiscussion.com/biochemistry/immunochemical-techniques/top-7-types-ofimmunochemical-techniques-used-in-biochemistry/12525
  • https://www.learninsta.com/antigen-antibody-reactions/
  • https://byjus.com/biology/elisa-technique/

Διαβάστε επίσης:

Schreibe einen Kommentar